Действие происходит в Испании в 1568 г., на тринадцатом году царствования короля Филиппа II. Основу сюжета составляет история взаимоотношений Филиппа II, его сына дона Карлоса, наследника испанского престола, и жены — королевы Елизаветы.

В Аранжусе, резиденции испанского короля близ Мадрида, находится весь испанский двор. Здесь и сын короля — дон Карлос. Король холоден к нему, он занят государственными делами и своей молодой женой, которая прежде была невестой дона Карлоса. К сыну же Филипп II приставил своих слуг, чтобы они шпионили за ним.

В Аранжус приезжает из Фландрии маркиз Поза, друг детства принца, с которым у него связаны трогательные воспоминания. Инфант открывается ему в преступной любви к своей мачехе, и маркиз устраивает дону Карлосу свидание с Елизаветой наедине. В ответ на пылкие любовные признания принца она просит его направить свою любовь на несчастное испанское королевство и передаёт ему несколько писем со «слезами Нидерландов».

Прочтя эти письма, дон Карлос решает просить отца назначить его наместником в Нидерланды, вместо предполагаемого на эту должность жестокого герцога Альбы. Это намерение одобряет и маркиз Поза.

Двор короля переезжает в королевский дворец в Мадриде. С трудом дон Карлос добивается аудиенции у Филиппа. Он просит послать его во Фландрию, где он обещает усмирить бунт в Брабанте. Король отказывает, он считает, что место принца при дворе, во Фландрию же отправится герцог Альба.

Дон Карлос разочарован, в это время паж королевы передаёт ему тайно любовную записку с просьбой прийти на свидание на половину Елизаветы. Принц уверен, что записка от королевы, он приходит в указанное место и встречает там фрейлину Елизаветы, принцессу Эболи. Инфант в недоумении. Эболи объясняется ему в любви, она ищет у него защиты от посягательств на собственную невинность и в доказательство даёт принцу письмо. Дон Карлос с трудом начинает понимать свою трагическую ошибку, принцесса же, видя равнодушие к ней, догадывается, что знаки внимания инфанта, которые она принимала на свой счёт, на самом деле относились к королеве. Эболи гонит принца, но перед этим просит вернуть ей ключ, который передал дону Карлосу паж, и любовное письмо к ней короля, которое она только что сама дала принцу. Дон Карлос поражён известием об отношении Филиппа к принцессе Эболи, он уходит, но письмо уносит с собой.

Между тем при дворе короля у принца есть враги, которым не нравится неуравновешенный нрав наследника престола. Духовник короля Доминго и герцог Альба считают, что такой монарх будет очень неудобен на испанском троне. Единственное средство убрать дона Карлоса — это заставить поверить короля в любовь королевы к сыну, в этом деле, как сообщает Доминго, у них есть союзница — принцесса Эболи, в которую влюблён Филипп.

Узнав об отказе короля послать во Фландрию принца, Поза огорчается. Дон Карлос показывает другу письмо короля к принцессе Эболи. Маркиз предостерегает инфанта от интриг оскорблённой принцессы, но в то же время стыдит его за желание воспользоваться похищенным письмом. Поза разрывает его и в ответ на страдания несчастного инфанта обещает вновь устроить его свидание с королевой.

От герцога Альбы, Доминго и принцессы Эболи Филипп II узнает об «измене» Елизаветы, он теряет покой и сон, ему везде мерещатся заговоры. В поисках честного человека, который помог бы ему установить истину, взгляд короля останавливается на маркизе Поза.

Разговор Филиппа с маркизом больше всего напоминает разговор слепого с глухим. Поза считает своим долгом прежде всего замолвить слово за свою страдающую Фландрию, где душат свободу людей. Старик же монарх печётся лишь о личном благополучии. Филипп просит маркиза «войти в доверие к сыну», «испытать и сердце королевы» и доказать свою преданность престолу. уходя, благородный гранд все же надеется, что ему удастся добиться свободы для своей родины.

В качестве посланника Филиппа Поза получает свидание наедине с королевой. Он просит Елизавету уговорить дона Карлоса отправиться в Нидерланды без благословения короля. Он уверен, что королевскому сыну удастся собрать под свои знамёна «бунтовщиков», и тогда отец, увидев усмирённую Фландрию, сам назначит ею наместником в эту провинцию. Королева сочувствует патриотическим планам маркиза Позы и назначает дону Карлосу свидание.

Маркиз Поза передаёт королю личные письма дона Карлоса. Среди них монарх по почерку узнает записку принцессы Эболи, которая, желая доказать измену Елизаветы мужу, взломала шкатулку королевы и выкрала письма дона Карлоса, написанные Елизавете, как оказалось, ещё до её замужества. Поза просит у короля бумагу с его подписью, которая позволила бы ему в крайнем случае арестовать неуравновешенного принца. Филипп даёт такой документ.

При дворе поведение маркиза Позы вызывает недоумение, которое достигает предела, когда гранд приказывает арестовать дона Карлоса на основании письма короля. В это время появляется директор почты дон Раймонд де Таксис, он приносит письмо Позы, которое адресовано принцу Оранскому, находящемуся в Брюсселе. Оно должно всем все разъяснить.

Принцесса Эболи сообщает Елизавете об аресте инфанта и, терзаемая муками совести, сознаётся в своём злодействе против королевы, та приказывает сослать её в монастырь святой Марии.

После свидания с королевой, на котором он просит Елизавету напомнить принцу об их юношеской клятве, маркиз Поза отправляется в тюрьму к своему другу дону Карлосу. Зная, что эта их встреча последняя, он раскрывает инфанту свой план. Чтобы спасти Карлоса, он написал письмо принцу Оранскому о своей мнимой любви к королеве и о том, что инфант дон Карлос был выдан им Филиппу лишь для отвода глаз. Поза уверен, что его письмо попадёт в руки монарха. Принц потрясён, он готов бежать к отцу-королю просить прощения для себя и маркиза, но поздно: раздаётся выстрел, маркиз Поза падает и умирает.

В тюрьму, чтобы освободить сына, приходит Филипп с грандами. Но вместо благодарного и покорного дона Карлоса он находит там убитого горем человека, который обвиняет короля в смерти друга. Вокруг тюрьмы нарастает шум, это в Мадриде начинается мятеж народа, который требует освобождения принца.

В это время в руки к шпионам герцога Альбы попадает монах-картезианец. При нем были письма маркиза Позы во Фландрию, в которых речь идёт о побеге наследного принца в Нидерланды, где он возглавит восстание за независимость этой страны. Письма герцог Альба незамедлительно передаёт испанскому королю.

Король Филипп призывает к себе Великого инквизитора. Его мучит мысль, что детоубийство является тяжким грехом, в то время как он решил избавиться от своего сына. Чтобы умиротворить свою совесть, старый монарх хочет заручиться в своём преступлении поддержкой церкви. Великий инквизитор говорит, что церковь способна простить сыноубийство и приводит аргумент: "Во имя справедливости извечной сын божий был распят*. Он готов принять на себя ответственность за смерть инфанта, только бы на троне не оказался поборник свободы.

Наступает ночь, дон Карлос приходит на свидание с Елизаветой. Он отправляется во Фландрию, полный решимости во имя дружбы совершить то, о чем они мечтали с маркизом. Королева благословляет его. Появляется король с Великим инквизитором. Королева падает в обморок и умирает, Филипп без тени сомнения передаёт своего сына в руки Великого инквизитора.