«Люди, неискушённые в подвиге добродетели, могут посчитать для себя выигрышным предаться пороку, вместо того чтобы оказывать ему сопротивление». Поэтому «необходимо представить силу примеров несчастной добродетели», способной привести к добру «испорченную душу, если в той сохраняются, по крайней мере, какие-либо добрые начала». Таковыми стремлениями руководствуется автор романа, в мрачной гротескной форме живописуя современные ему нравы.

Судьба подвергает сестёр Жюстину и Жюльетту суровому испытанию: умирают родители, и девушки оказываются на улице без средств к существованию. Красавица Жюльетта вступает на стезю разврата и быстро превращает последний в источник дохода, а столь же очаровательная сестра её во что бы то ни стало хочет остаться добродетельной. Через несколько лет Жюльетта, погрязнув в пороке и запятнав себя множеством преступлений, среди которых убийства мужа, незаконных детей и любовников, добивается всего, чего желала: она — графиня де Лорзанж, богатая вдова, у неё есть любовник, почтенный господин де Корвиль, живущий с ней, как с законной супругой.

Однажды, путешествуя вместе с де Корвилем, на постоялом дворе Жюльетта встречает девушку, которую везут в Париж для вынесения ей смертного приговора: девица обвиняется в убийстве, воровстве и поджоге. Нежное и печальное лицо красавицы пробуждает в душе графини неведомое ей доселе сострадание, с дозволения жандармов она привечает девушку и просит её рассказать свою историю. Девушка соглашается, однако отказывается раскрыть своё происхождение. Впрочем, читатель наверняка догадался, что перед ним — несчастная Жюстина, так что в дальнейшем мы будем называть девицу её настоящим именем.

Оказавшись за воротами монастыря одна и без денег, Жюстина решает наняться в прислуги, но вскоре с ужасом убеждается, что получить место можно только поступившись своей добродетелью. Наконец её берет в услужение богатый ростовщик. Он подвергает испытанию порядочность Жюстины — заставляет её обокрасть богатого соседа. Когда же она отказывается, он обвиняет её в краже, и девушку сажают в тюрьму. Там она знакомится с авантюристкой Дюбуа и вместе с ней бежит из заточения.

Разбойница Дюбуа заставляет Жюстину вступить в банду, а когда та отказывается, отдаёт её на поругание разбойникам. Каждодневно терпя моральные и физические мучения, Жюстина остаётся в шайке, но всеми силами пытается сохранить свою девственность. Однажды разбойники захватывают в плен некоего Сент-Флорента; Жюстина из человеколюбия помогает пленнику совершить побег и сама бежит вместе с ним. Но Сент-Флорент оказывается негодяем: он оглушает Жюстину, в бессознательном состоянии насилует её и бросает в лесу на произвол судьбы.

Истерзанная Жюстина нечаянно становится свидетельницей противоестественной связи графа де Бриссака с его лакеем. Обнаружив девушку, граф сначала запугивает её до полусмерти, но потом меняет гнев на милость и устраивает её горничной к своей тётке. Несмотря на очаровательную внешность, в душе господина де Бриссака обитают всевозможные пороки. Стремясь внушить Жюстине принципы своей извращённой морали, он приказывает ей отравить тётушку. Перепуганная Жюстина рассказывает все госпоже де Бриссак. Старушка возмущена, а граф, поняв, что его предали, выманивает Жюстину из дома, срывает с неё одежды, травит собаками, а потом отпускает на все четыре стороны.

Кое-как Жюстина добирается до ближайшего городка, находит врача, и тот исцеляет её раны. Так как у Жюстины кончаются деньги, она отваживается написать графу де Бриссаку, дабы тот вернул причитающееся ей жалованье. В ответ граф сообщает, что тётушка его скончалась от яда, отравительницей считают Жюстину и полиция разыскивает её, так что в её интересах скрыться где-нибудь в укромном месте и более его не беспокоить. Расстроенная Жюстина доверяется доктору Родену, и тот предлагает ей место служанки у себя в доме. Девушка соглашается.

Помимо врачевания Роден содержит школу, где совместно обучаются мальчики и девочки, все как на подбор очаровательные. Не в силах понять, в чем тут дело, Жюстина принимается расспрашивать дочь доктора Розалию, с которой она успела подружиться. С ужасом Жюстина узнает, что доктор предаётся разврату как с учениками, так и с собственной дочерью. Розалия отводит Жюстину в потайную комнату, откуда та наблюдает чудовищные оргии, устраиваемые Роденом с подвластными ему жертвами. Тем не менее Жюстина по просьбе Розалии остаётся в доме доктора и начинает наставлять подругу в христианской вере. Неожиданно Розалия исчезает. Подозревая её отца в очередной чудовищной проделке, Жюстина обыскивает дом и находит свою подругу запертой в потайном чулане: Роден решил умертвить дочь, произведя над ней некую хирургическую операцию. Жюстина устраивает Розалии побег, но сама попадает в руки доктора; Роден ставит ей на спину клеймо и отпускает. Жюстина в ужасе — ей и так вынесен приговор, а теперь ещё и клеймо... Она решает бежать на юг, подальше от столицы.

Жюстина выходит к монастырю, где хранится чудотворная статуя Святой Девы, и решает пойти помолиться. В обители её встречает настоятель дон Северино. Благородная внешность и приятный голос настоятеля внушают доверие, и девушка чистосердечно рассказывает ему о своих злоключениях. Убедившись, что у Жюстины нет ни родных, ни друзей, монах меняет тон, грубо хватает её и тащит в глубь монастыря: за фасадом святой обители скрывается гнездо разврата и порока. Четверо отшельников во главе с настоятелем залучают к себе девиц, чьё исчезновение не влечёт за собой никаких последствий, заставляют их участвовать в оргиях и предаваться самому разнузданному разврату, удовлетворяя извращённое сладострастие святой братии. В зависимости от возраста девушек делят на четыре разряда, у каждого разряда свой цвет одежд, свой распорядок дня, свои занятия, свои наставницы. Крайняя осторожность святых отцов и их высокое положение делают их неуязвимыми. Женщин, наскучивших монахам, отпускают на свободу, но, судя по некоторым намёкам, свобода эта означает смерть. Бежать из обители невозможно — на окнах толстые решётки, вокруг рвы и несколько рядов колючей живой изгороди. Тем не менее истерзанная Жюстина, едва не испустившая дух под розгами развратников, решается бежать. Случайно найденным напильником она перепиливает оконную решётку, продирается сквозь колючие кусты, скатывается в ров, наполненный трупами, и в ужасе бежит в лес. Там она опускается на колени и возносит хвалы Господу. Но тут двое незнакомцев хватают её, накидывают на голову мешок и куда-то волокут.

Жюстину приводят в замок графа де Жернанда, престарелого развратника огромного роста, приходящего в возбуждение только при виде крови. Жюстине предстоит прислуживать его четвёртой жене, угасающей от постоянных кровопусканий. Добросердечная девушка соглашается помочь своей несчастной госпоже — передать письмо её матери. Но увы! Спустившись по верёвке из окна замка, она попадает прямо в объятия хозяина! Теперь Жюстину ждёт наказание — медленная смерть от потери крови. Внезапно раздаётся крик: «Госпожа при смерти!», и Жюстина, воспользовавшись суматохой, бежит прочь из замка. Вырвавшись из лап страшного графа, она добирается до Лиона и решает заночевать в гостинице. Там её встречает Сент-Флорент; он предлагает ей стать при нем сводней, которая обязана поставлять ему по две девственницы в день. Жюстина отказывается и спешно покидает город. По дороге она хочет подать милостыню нищенке, но та бьёт её, вырывает кошелёк и убегает. Взывая к Господу, Жюстина идёт дальше. Встретив раненого мужчину, она оказывает ему помощь. Придя в сознание, господин Ролан приглашает её к себе в замок, обещая место горничной. Жюстина верит, и они вместе пускаются в путь. Едва приблизившись к мрачному уединённому жилищу Ролана, девушка понимает, что её опять обманули. Ролан — главарь банды фальшивомонетчиков; сначала он заставляет несчастную Жюстину крутить тяжёлый ворот, а потом швыряет в подземелье, где терзает её, дабы удовлетворить своё вожделение. Бедняжку кладут в гроб, подвешивают, избивают, бросают на горы трупов...

Неожиданно приезжают жандармы; они арестовывают Ролана и везут на суд в Гренобль. Благородный судья верит в невиновность Жюстины и отпускает её. Девушка покидает город. Ночью в гостинице, где она остановилась, случается пожар, и Жюстина попадает в тюрьму по обвинению в поджоге. Несчастная обращается за помощью к Сент-Флоренту, тот похищает её из темницы, но лишь затем, чтобы помучать и надругаться над ней. Утром Сент-Флорент возвращает девушку в тюрьму, где ей выносится смертный приговор.

Выслушав рассказ несчастной, графиня де Лорзанж узнает Жюстину, и сестры с рыданием падают друг другу в объятия.

Господин де Корвиль добивается освобождения и оправдания девушки; госпожа де Лорзанж увозит её к себе в поместье, где Жюстина наконец сможет зажить спокойно и счастливо. Но судьба распоряжается иначе: в окно замка влетает молния и убивает Жюстину. Сестра её Жюльетта раскаивается в прошлых своих грехах и уходит в монастырь. Нам же остаётся только проливать слезы над несчастной судьбой добродетели.